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云序客户m6A高分文章|揭示组蛋白乙酰化与m6A修饰在眼部黑色素瘤发生中的共同作用机制

组蛋白乙酰化是基因调控的重要表观遗传标记，n6 - methylladenine (m6A) RNA修饰也是最常见的RNA修饰，尽管人们对组蛋白乙酰化和m6A修饰在肿瘤发生调控中的作用进行了大量的研究，但目前对这两种基本修饰之间的相互作用缺乏全面的了解。

2023年7月19日，云序生物客户：上海交通大学医学院附属第九人民医院眼科范先群院士、贾仁兵教授、柴佩韦博士为文章通讯作者，庄艾等为第一作者，以“Targeting histone deacetylase suppresses tumor growth through eliciting METTL14-modified m⁶A RNA methylation in ocular melanoma”为题在《Cancer Communication (Lond)》杂志发表研究论文，该研究以黑色素瘤细胞和正常黑色素细胞系为对象，通过m6A MeRIP-seq、RNA-seq、CUT&Tag、单细胞测序等多组学分析。揭示HDACis通过协调m⁶A修饰来发挥抗癌作用，从而揭示眼部黑色素瘤中HDAC/METTL14/FAT4表观遗传级联的“组蛋白-RNA互作”反应。

发表期刊：Cancer Communications

影响因子：16.6 Q1

发表时间：2023年7月19日

研究方法：m6A MeRIP-seq、RNA-seq、CUT&Tag、单细胞测序

文章链接：Targeting histone deacetylase suppresses tumor growth through eliciting METTL14-modified m⁶A RNA methylation in ocular melanoma

技术路线

材料方法

葡萄膜黑色素瘤细胞（MEL290，OMM2.3和OMM1）
人结膜黑色素瘤细胞（CRMM1，CRMM2和CM2005.1）
葡萄膜黑色素瘤细胞系MUM2B
葡萄膜黑色素瘤细胞系92.1
人视网膜色素上皮细胞系ARPE-19
皮肤黑色素瘤细胞系（A375和SK28）
正常人黑色素细胞系PIG1

全文摘要

首先进行组蛋白修饰抑制剂HDACis对眼部黑色素瘤的抑制作用研究。使用Dot blot法检测整体m⁶A RNA修饰水平。

利用RNA-seq、CUT&Tag、单细胞测序、甲基化RNA免疫沉淀测序（m6A MeRIP-seq）和m⁶A单核苷酸分辨交联和免疫沉淀测序(miCLIP-seq)，以揭示HDACis对眼部黑色素瘤中甲基转移酶（METTL14）和FAT肿瘤抑制同源物4（FAT4）的作用机制。

采用实时荧光定量聚合酶链反应（qPCR）、western blotting和免疫荧光染色法检测METTL14和FAT4在眼黑色素瘤细胞和组织中的表达。

建立细胞模型和异种原位移植 (Orthotopic Xenograft) 肿瘤模型以鉴定METTL14和FAT4在眼部黑色素瘤生长中的作用。

采用RIP-qPCR、m6A MeRIP-seq、miCLIP-seq和RNA稳定性实验来研究FAT4对m⁶A水平的作用机制。

研究结果

1、HDACis对眼部黑色素瘤具有肿瘤选择性攻击作用

为了分析表观遗传药物的临床潜力，本研究对245种表观药物进行了高通量抑制剂库筛选。经过第一轮筛选和第二轮验证，筛选验证结果揭示三种组蛋白去乙酰化抑制剂(HDACis) 表现出肿瘤选择性抑制，选择性指数>5，分别是LBH589、RG2833和LMK-235。在3个HDACis中，LBH589在眼部黑色素瘤细胞中表现出最高的选择性指数（>10）和最低的IC50值。表明LBH589在治疗眼部黑色素瘤方面表现出高效和低毒性。

为了验证LBH589在体内诱导的抑制作用，通过带有荧光素酶标签的92.1细胞建立了眼部黑色素瘤异种原位移植肿瘤模型。动物成像显示，与对照组相比，LBH589处理组表现出生物发光信号和肿瘤体积均降低。表明LBH589在体外和体外选择性地抑制眼部黑色素瘤。

2、HDAC通过诱导METTL14表达激活m⁶A修饰

为分析LBH589的下游靶标，研究对LBH589处理的92.1细胞进行高通量转录组分析（RNA-seq），RNA-seq数据显示，2841个基因表达上调，2086个基因表达下调。下调基因主要富集在细胞周期、细胞分裂和DNA复制过程中，支持在眼部黑色素瘤中观察到的LBH589诱导的抑制表型。大多数上调基因（1776/2841，62.5%）表现出差异m⁶A甲基化水平（m6A MeRIP-seq和miCLIP-seq数据），表明HDAC抑制可能调控整体m⁶A甲基化模式。随后利用dot blot法检测整体m⁶A甲基化水平，结果揭示黑色素瘤细胞中的m⁶A甲基化水平低于正常黑色素细胞，这与黑色素瘤中的其他m⁶A发现一致。研究发现经LBH589处理后，眼部黑色素瘤细胞中的整体m⁶A甲基化增加，表明HDAC抑制可恢复眼部黑色素瘤中m⁶A甲基化水平。

随后，作者探索了LBH589诱导m⁶A甲基化激活的分子机制。对m⁶A相关修饰酶包括writer蛋白（METTL3、METTL14和WTAP）、eraser蛋白（ALKBH5和FTO）和reader蛋白（YTHDF1-3）的RNA-seq数据进行分析。分析结果表明，METTL14在LBH589处理的黑色素瘤细胞中显著增加，其他与m⁶A相关的修饰酶保持不变。且METTL14在mRNA和蛋白水平上均被激活。这些数据表明HDAC抑制诱导了METTL14的显著上调，导致眼部黑色素瘤中整体m⁶A甲基化水平的激活。

3、METTL14在眼部黑色素瘤中低乙酰化

由于METTL14参与LBH589介导的m⁶A激活，作者分析了眼部黑色素瘤中的METTL14乙酰化状态和表达水平。结果揭示了与正常色素细胞相比，眼部黑色素瘤细胞在METTL14启动子中表现出降低的H3K27Ac和H3K9Ac丰度。且HDAC抑制进一步增加了眼黑色素瘤细胞中METTL14的H3K27Ac和H3K9Ac水平。研究结果表明METTL14在眼部黑色素瘤中低乙酰化，但这种低乙酰化可以通过HDAC抑制来回复。

4、FAT4是METTL14的下游标靶基因

作者研究了METTL14在眼部黑色素瘤中的抑癌作用机制。使用多组分析鉴定了三个符合以下标准的基因（CRYBG3、FAT4、SEMA3D）：在METTL14过表达后上调（蓝色圆圈，GSE215095）、在LBH589处理后上调（棕色圆圈，GSE214457），与TCGA队列中的METTL14呈正相关（红色圆圈，R>0.3，P<0.05），且在m⁶A修饰水平低的肿瘤中下调（绿色圆圈，GSE176345）（黄色圆圈，GSE137675）。在这三个基因中，只有FAT4表现出预后价值，且在TCGA队列中与METTL14平行表达（R=0.471，P<0.001）。如RNA-seq可视化图所示，METTL14过表达和LBH589处理后，FAT4表达显著增加。且FAT4表达由LBH589处理诱导，在RNA和蛋白水平上与METTL14表达正相关。总之，研究结果表明FAT4可能参与METTL14介导的眼部黑色素瘤的肿瘤抑制。

5、FAT4在眼部黑色素瘤中的抑癌作用

尽管FAT4在许多癌症中是一种传统的抑癌因子，但其在眼部黑色素瘤中的功能仍然是个谜。本研究检测了眼部黑色素瘤样品和细胞系中的FAT4表达。与METTL14类似，眼部黑色素瘤临床样本中的FAT4水平显著降低，与复发率降低相关。FAT4的RNA和蛋白水平在眼部黑色素瘤细胞系中也降低。为了评估FAT4在METTL14介导的肿瘤抑制中的作用，作者在METTL14过表达的眼部黑色素瘤细胞系中沉默FAT4表达，结果表明FAT4敲除减弱了METTL14介导的肿瘤抑制，包括细胞聚落形成能力和转移能力。在异种原位移植肿瘤模型中，FAT4沉默消除了METTL14过表达诱导的肿瘤抑制。总之，这些结果表明FAT4参与了由METTL14介导的眼部黑色素瘤抑制网络。

6、YTHDF1识别m⁶A修饰增强了FAT4的RNA稳定性

由于METTL14是m⁶A修饰的甲基化转移酶（writer），作者研究了METTL14是否以m⁶A修饰依赖性方式调控FAT4表达。利用miCLIP-seq（图6A）和m6A MeRIP-seq（图6B）分析结果发现，眼黑色素瘤细胞系中的FAT4发生了低甲基化，与这些细胞中METTL14低水平表达一致。此外RIP分析发现FAT4在眼部黑色素瘤细胞中m⁶A显著低甲基化。外源性METTL14表达进一步增加了FAT4的m⁶A甲基化水平。总的来说，这些数据表明，METTL14负责催化FAT4 mRNA的m⁶A甲基化。

由于YTHDF家族蛋白负责识别m6A甲基化，而m6A甲基化在决定其RNA命运中发挥着重要作用，因此我们探究了这些“Reader”在FAT4调控中的作用。利用RIP-PCR，我们发现FAT4 mRNA在正常黑素细胞和mettl14过表达的眼部黑素瘤细胞中都特异性地与YTHDF1结合，而在其他reader蛋白(YTHDF2和3)与FAT4 mRNA之间观察到微弱的相互作用信号(图6C)。因此，沉默YTHDF1显著抑制了FAT4的表达，而在ythdf2 /3沉默的细胞中FAT4的表达保持不变(图6D)。有趣的是，外源性METTL14表达增加了FAT4 mRNA的稳定性，这与METTL14过表达细胞中FAT4表达的升高有关(图6E，紫色)。此外，YTHDF1的沉默显著削弱了FAT4 RNA的稳定性(图6E，棕色)，并破坏了mettl14介导的功能(图6E，绿色)。有趣的是，FAT4与YTHDF1显著正相关(R = 0.359, P <0.001)。

全文总结

研究结果首先表明了眼部黑色素瘤细胞对HDACis的易感性。HDACis触发眼黑色素瘤中m⁶A RNA修饰的升高。进一步的研究表明，METTL14是HDACis的下游候选基因。METTL14在组蛋白低乙酰化状态下沉默，而HDACi恢复了METTL14的正常组蛋白乙酰化水平，从而诱导其表达。随后，METTL14通过m⁶A-YTH N⁶-甲基腺苷RNA结合蛋白1依赖性方式促进肿瘤抑制因子FAT4表达，从而发挥肿瘤抑制作用。总之，本文揭示了HDACi恢复METTL14的组蛋白乙酰化水平，并随后在肿瘤发生过程中调控METTL14介导的m⁶A修饰。

这些结果表明，HDACis通过协调m⁶A修饰发挥抗癌作用，揭示了眼黑色素瘤中HDAC/METTL14/FAT4表观遗传级联的“组蛋白-RNA互作”。