在细胞培养的微观世界里,消化酶如同精准的 “细胞解读者”,肩负着分离贴壁细胞、拆解组织屏障的关键使命。今天,我们就来深入探讨三种主流消化酶的特性与应用,助你在实验中精准选择 “得力助手”。
作为丝氨酸蛋白酶家族的代表,胰蛋白酶凭借对赖氨酸、精氨酸肽键的切割能力,成为贴壁细胞传代的经典之选。它通过水解细胞表面黏附蛋白(如层粘连蛋白)瓦解细胞间连接,搭配 EDTA 螯合钙镁离子,可显著提升消化效率。
核心应用
✅适用细胞:HEK293、HeLa 等常规贴壁细胞。
✅使用浓度:0.05%-0.25%(推荐 0.25% 胰酶 + 0.02% EDTA)。
✅操作要点:37℃孵育 1-5 分钟,需用含血清培养基中和残留酶活性。
注意事项
⚠️ 消化时间需严格把控,避免细胞膜功能蛋白损伤
⚠️ 消化过程呈现 “从贴壁到悬浮” 的典型变化(见图 1-3)
*0.25%胰酶-0.02% EDTA消化HuH-7(人肝癌细胞),消化前中后的照片。
图1:消化前(细胞贴壁,紧紧挨着)

图2:消化中(可以看到类似藕断丝连的现象)

图3:消化后(细胞脱落,漂浮,聚团)
源自溶组织梭状芽孢杆菌的胶原酶,是破解结缔组织的 “专业选手”。它靶向水解胶原蛋白肽键,对细胞损伤极小,尤其适合纤维性组织、上皮及癌组织的分离。根据组织硬度差异,胶原酶分为多种类型:
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Ⅰ型胶原酶:用于较硬组织(如肝脏、肿瘤组织)。用于上皮、肺,脂肪和肾上腺组织细胞的分离。用于消化组织中连接部分使其成为单个细 胞,用于哺乳动细胞的分离。
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Ⅱ型胶原酶:适用于胰腺、心脏,肝脏,骨,甲状腺,和唾液腺组织细胞的分离
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Ⅲ型胶原酶:对所有哺乳动物组织均有消化作用
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Ⅳ型胶原酶:包含至少7种蛋白酶成分,分子量从68-130KD不等。更温和,用于原代细胞分离(如内皮细胞、干细胞)。 浓度:0.1-2 mg/mL,根据组织类型调整。
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Ⅴ型胶原酶:包含至少7种蛋白酶成分,分子量从68-130KD不等。它可用于胰腺小岛组织的分离,将结缔组织分离成单个细胞。
✅ 不受钙镁离子及血清影响
✅ 可与透明质酸酶联用增强效果
✅ 肝细胞分离实验显示:胶原酶混合物得率与成活率双高(见下图)
应用举例:不同酶消化法提取猪原代肝细胞的效果比较(南京大学)
周徐倩,董磊*
(南京大学,江苏 南京 210023)
不同酶消化法提取猪原代肝细胞的效果比较[J].现代畜牧科技,2024,107(4):53-55. doi:10.19369/j.cnki.2095-9737.2024.04.014.
上述文献采用离体酶消化法,比较胰蛋白酶、II型胶原酶、IV型胶原酶、II型和IV型胶原酶混合物提取猪原代肝细胞的效果。结果显示,这4种酶消化法均能获得有功能的肝细胞,其中胶原酶混合物分离的肝细胞数量最多,胰蛋白酶法分离的肝细胞数量较少,II型、IV型胶原酶消化法分离的肝细胞排列整齐、边界清晰。
需要注意的是,无论使用何种酶消化,均需要精细地控制酶的用量、消化时间和温度,避免因消化不充分或过度消化影响细胞的得率和活性。
这款由蛋白酶、胶原酶等组成的混合酶液,堪称细胞消化界的 “多面手”。其温和特性尤其适合干细胞、原代细胞及表面标志物检测场景,无需血清中和即可直接离心,大幅简化操作流程。
使用注意:不要在温水浴中解冻本品。
Accutase对37 °C以上温度敏感,在37 °C下45分钟后会失活。建议放在冰箱中过夜解冻,或放在一盆冷的自来水中解冻1-1.5小时。
Accutase解冻后,摇动瓶子使溶液混匀。本品无需在使用前加热。从冰箱中取出后应立即使用,用完后放回冰箱。 Accutase融化后4℃保存,至少2个月稳定。不可室温保存。也可分装成单次用量,放到-80 ℃冻存,有效期2年。
1)适用于绝大多数原代细胞和哺乳动物细胞系的消化,以及昆虫细胞;
2)温和有效的消化,冻存后细胞具更高复苏率;
3)几分钟内实现粘附细胞的分离,不需清洗或中和反应,节省细胞传代时间;
4)对细胞消化较为温和,能增加细胞产量和存活率;增强细胞贴壁效率;改善细胞形态和细胞生长特性等。
Accutase与胰酶Trypsin在流式检测
消化细胞上的应用对比

流式检测数据显示:凋亡率显著低于传统胰酶(见上图)。
截图文献:Annexin V/ PI 法流式细胞术检测细胞凋亡的影响因素. DOI:10. 16519/ j. cnki. 1004⁃311x. 2022. 06. 0112
上述细胞凋亡流式检测图可以看到:对于未处理细胞而言,与无EDTA 胰酶相比,Accutase能显著减少凋亡率(2.70% vs 18.05%);而经药物处理的细胞,Accutase组凋亡率也有一定程度减少(22.32% vs26.50%),但差异没有未处理细胞大。但都可以看出使用Acuutase处理需要流式检测的细胞,优势是很明显的。
细胞培养中常用的消化酶还有中性蛋白酶,分散酶,透明质酸酶等多种,在此就不再一一展开介绍了。下面总结一下常用消化酶的选择依据:
1. 细胞类型:
- 常规传代细胞:胰蛋白酶。
- 原代细胞或干细胞:胶原酶、Accutase。
2. 组织硬度:
-坚硬组织(肿瘤、肝脏):Ⅰ型胶原酶。
-柔软组织(脑、胚胎):分散酶。
3. 实验需求:
-需保留表面标志物:分散酶或Accutase。
-快速消化:胰酶+EDTA。
🔹 常规传代首选胰酶,搭配 EDTA 提升效率
🔹 原代分离根据组织类型匹配胶原酶亚型
🔹 敏感细胞或表面标志物检测优先 Accutase
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