来自APT客户发表文章，翻译后修饰 LC-MS/MS 由中科新生命完成。

Glucose Sensor MdHXK1 Phosphorylates and Stabilizes MdbHLH3 to Promote Anthocyanin Biosynthesis in Apple

PLoS Genet. 2016 Aug 25;12(8):e1006273. doi: 10.1371

研究背景

葡萄糖是植物体内重要的调节因子之一，可以诱导苹果中花青素积累。已有文章报道HXK1（己糖激酶1）参与了葡萄糖的调控过程。本篇文章通过对蛋白质间的相互作用研究解析了MdHXK1调控花青素合成的分子机制。

样本来源

茎段，来源于‘Gala’ apple； 愈伤组织，来源于‘Orin’ apple (Malus domestica Borkh.)的早期胚胎；苹果果实，来源于‘Red Delicious’

技术

蛋白互作研究（酵母双杂交，Co-IP，GST pull-down），LC-MS/MS(shotgun)，蛋白磷酸化位点鉴定，体内体外磷酸化实验，植物转基因技术，花青素含量测定

研究结果

1、之前研究表明葡萄糖可以诱导拟南芥中花青素的合成。本文通过诱导茎段培养实验证明葡萄糖同样可以引起苹果中花青素的积累；HXK抑制剂葡萄糖胺（glucosamine）却可以抑制葡萄糖对花青素的诱导作用，这说明HXK参与葡萄糖对花青素含量的调控过程。

S1 Fig Glucose promotes anthocyanin accumulation in anHXK-dependent manner in apple.

2、MdHXK1作为糖代谢酶还可以通过其催化功能参与生物功能调节作用。本文通过构建MdHXK1的突变体植株（催化功能缺失，参考之前拟南芥中的发现）发现调节花青素的积累主要通过葡萄糖信号途径，但催化途径也会有一定的作用（低浓度糖实验的发现，S3 Fig）。

Fig 1. MdHXK1modulates anthocyanin accumulation mainly through the glucose signalingpathway.

3、通过Co-IP结合LC-MS/MS实验筛选与MdHXK1互作的蛋白，共得到164个可能蛋白，其中就包括bHLH型转录因子MdbHLH3。

S1Text Identification ofMdHXK1-interacting proteins in co-immunoprecipitation using an LC/MS assay.

4、利用酵母双杂交缺失突变体实验发现MdHXK1与MdbHLH3互作必需区域： MdbHLH3的C-terminus（MdbHLH3346-709aa）和MdHXK1的hexokinase_2 domain（MdHXK1245-498aa）；之后用Co-IP和GST pull-down实验确证了MdHXK1与MdbHLH3间的互作关系。

Fig 2. MdHXK1physically interacts with MdbHLH3.

5、Western blotting分析发现葡萄糖可以引起MdbHLH3蛋白磷酸化，之后利用质谱方法寻找MdbHLH3的磷酸化位点：Ser361，通过Westernblotting确定位点的准确性；进一步实验发现磷酸化程度随着葡萄糖浓度以及处理时间的增加逐渐增强。

Fig 3. Glucoseinduces the phosphorylation of the MdbHLH3 protein at the Ser361 site.

6、本文通过比较WT，MdHXK1过表达和基因沉默植株中MdbHLH3磷酸化水平证明MdHXK1参与了葡萄糖诱导的MdbHLH3磷酸化；之后通过体外和体内磷酸化实验证明MdHXK1催化了MdbHLH3的磷酸化。通过缺失突变体实验发现MdHXK1蛋白的信号肽和hexokinase_2 domain区域对于MdHXK1的细胞核定位以及磷酸化MdbHLH3是必须的。

Fig 4. MdHXK1mediates the glucose-induced phosphorylation of the MdbHLH3 protein.

7、磷酸化不仅可以增强MdbHLH3蛋白的稳定性，还可以增强其对下游基因的转录激活能力。

Fig 5. Phosphorylationmodification stabilizes the MdbHLH3 protein and enhances its binding capacityto the promoters of downstream genes.

8、通过对转基因植株中基因表达以及花青素含量分析证明MdHXK1可以通过磷酸化修饰MdbHLH3促进花青素的合成。

Fig 6. MdHXK1controls anthocyanin accumulation via MdbHLH3 in apple calli.

9、本文之前的体内实验均是以苹果愈伤组织为实验对象，作者最后在苹果果实中验证了他们的结论：MdHXK1通过MdHLH3调控苹果果实中花青素的积累。

Fig 7. Transientexpression of MdHXK1 and MdbHLH3 via theviral vector-based transformation alters anthocyanin levels in apple fruits.

10、最后是作者给出的调控模型：葡糖糖信号激活MdHXK1，进而磷酸化MdHLH3，激活花青素合成相关基因的转录与表达。

Fig8. Model demonstrating that MdHXK1 protein kinase stabilizes MdbHLH3 via phosphorylationto modulate anthocyanin accumulation in response to glucose in apple.

小编心得

本文是一篇非常典型的利用蛋白质组学和修饰蛋白质组学辅助研究蛋白相互作用的文章，于2016年8月发表在PLOSGenetics上。整体思路非常清晰：通过Co-IP结合shotgun技术筛选互作蛋白；利用经典酵母双杂交、Co-IP以及Pull down验证互作关系；利用修饰蛋白组学寻找互作引起的蛋白修饰形式及位点，推测互作的生理机制；最后通过构建一系列转基因植物，检测多种生理指标，体内验证互作的生物学意义，非常值得大家借鉴。此外，本文内容非常详实，工作量很大，蛋白质组学和修饰蛋白质组学的应用极大提高了蛋白和修饰位点筛选的时效性和准确率。

推荐老师另两篇很赞的文章，大家可以鉴赏一番：

MdSOS2L1 phosphorylates MdVHA-B1 to modulate malate accumulation in response to salinity in apple. Plant Cell Rep. 2016 Mar;35(3):705-18. doi: 10.1007

Overexpression of MdSOS2L1, a CIPK protein kinase, increases the antioxidant metabolites to enhance salt tolerance in apple and tomato. Physiol Plant. 2015 Jun 10. doi: 10.1111

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